耶稣的左侧(从观众的角度)第一组使徒,包括了圣彼得(Saint Peter)、年轻的圣约翰(youthful Saint John)和犹大(Judas)。圣人彼得很生气地抓住一把刀,另一只在约翰耳朵前比划着,好像是说,如果是你的话,我会杀了你。这反映了彼得的急脾气。同时彼得的动作,也让人联想起晚餐后,一队士兵来逮捕耶稣时,彼得生气地用刀子切掉随队前来的高僧仆人马尔丘斯(Malchus)右耳的场景。年轻的约翰,对彼得的动作做出了回应,显示假装摔倒的姿态。犹大的脸背对着观众,右手握着一个钱包,默默注视着彼得的动作。耶稣右侧第一组是圣托马斯(Saint Thomas)、圣詹姆斯(Saint James the Less)和圣菲利普(Saint Philip),他们各自带有不同的疑问手势。所有的使徒,包括犹大都在桌子的同一边。但在其他画家的同类作品中,犹大单独在桌子的另一边。
达芬奇在这里运用了文艺复兴艺术的三原则:以人为本(Man's Centrality)体现在神(耶稣)有着人类的基本特征和属性;形式的美丽(Beauty of Form)借助的是经典的几何图形,搭配对称和适当的比例关系;而更高的智能(Superior Intellect)则运用的是新创立的透视理论准确描述空间和人物。
在神圣光线传递时,耶稣伸展手臂,上半身形成一个三角形,代表的是三位一体(Trinity)。即上帝、耶稣和圣灵为一体。其中圣灵(Holy Spirit)是上帝和耶稣共用的灵魂。耶稣右侧,圣人詹姆斯(James Less)向上的手势让人想起圣经中的声明:他是上帝的兄弟(he is the Lord´s brother)。耶稣伸展手臂,与詹姆斯本能地竖起向上的指头,组成十字架的造型,暗示耶稣会在十字架上遇难。摆放面包和酒的桌子象征着圣坛。耶稣宣称自己是祭品(以面包和酒作为标志),并通过手势和举止来表达。